ACTA.FAC.MED.NAISS. 1999; 16(2), 75-80
|
Stručno edukativni rad ACTA.FAC.MED.NAISS. 1999; 16(2), 75-80 |
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA HIV INFEKCIJE
Sonja Žerjav
| UVOD |
Sindrom stečene humane imunodeficijencije (AIDS) prvi put je opisan 1981, a virus prouzrokovač ovog oboljenja izolovan je 1983. (HTLV-III ili LAV, kasnije nazvan virus humane imunodeficijencije-HIV). Prvi testovi za detekciju specifičnih antitela pojavili su se 1984., a obavezno testiranje krvi u transfuzijama uvedeno je 1985. Nedovoljna osetljivost i specifičnost ELISA testova koji su tada bili u upotrebi navela je na razvoj potvrdnih testova i dalje usavršavanje testova za skriniranje. Širenje infekcije i pojava sve većeg broja obolelih zahtevali su uvodjenje testova za rano postavljanje dijagnoze i utvrdjivanje prognoze. Pojava antiretrovirusnih lekova ukazala je na neophodnost testova za praćenje uspešnosti terapije, a razvoj rezistentnih sojeva virusa i testova za ispitivanje osetljivosti virusa na pojedine lekove.
U laboratorijskoj dijagnostici HIV infekcije primenjuju se direktni i indirektni testovi. U direktne testove spadaju kultura virusa, test za dokazivanje HIV antigena p24 i PCR za detekciju delova virusnog genoma. Indirektnim testovima se dokazuje prisustvo antitela na HIV, što ukazuje na infekciju. Indirektni testovi mogu biti testovi za skriniranje (EIA, ELISA, brzi precipitacioni testovi) ili potvrdni, konfirmacioni testovi (Western blot, IFA i RIPA) (1, 2, 3). Najčešće se kao skrining testovi primenjuju EIA i ELISA, a kao potvrdni test Western blot.
| INDIREKTNI TESTOVI |
1. Testovi za prvi pregled (za skriniranje): Imunoemzimski testovi (ELISA, EIA) se odlikuju visokom osetljivošću i specifičnošću, jednostavni su za izvodjenje, imaju visoku reproducibilnost, pogodni su za automatizaciju i time skriniranje velikog broja uzoraka, i imaju nisku cenu. Prvi testovi detekovali su samo HIV-1 infekciju i pojavili su se 1985. Prvenstveno su bili namenjeni za skriniranje davalaca krvi (transfuzije). Od tada se primenjuju i za postavljanje kliničke dijagnoze, testiranje osoba izloženih riziku od HIV infekcije i za epidemiološka istraživanja. Testovi za istovremenu detekciju HIV 1 i 2 infekcije pojavili su se 1992. (4, 5, 6), a 1999. pojavio se i test za istovremenu detekciju HIV 1 i 2 antitela (uključujući i ona za podtip O HIV-a 1) i HIV antigena p24.
Po principu imunoenzimski testovi mogu biti indirektni, kompetitivni ili "sendvič". Za čvrstu fazu (mikrotitracina ploča, polistirenske kuglice ili membrana), vezani su virusni antigeni koji mogu biti lizat celog virusa, prečišćeni virusni proteini, rekombinantni proteini, sintetski peptidi ili njihova kombinacija. Uzorci za ispitivanje prisustva antitela mogu biti puna krv, serum, plazma, ispirak sasušene kapi krvi, urin, pljuvačka, cerebrospinalna tečnost (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14).
Testovi koji su se prvi pojavili kao antigen su koristili lizat celog virusa koji je kultivisan u limfomonocitima. Zbog nemogućnosti potpunog prečišćavanja i zaostajanja različitih nevirusnih komponenata, javljali su se lažno pozitivni rezultati (zajednički epitopi za HIV i druge viruse, bakterije, gljivice ili limfocite). Rekombinantni proteini koji se proizvode genetskim inženjeringom na bakterijama ili gljivicama takodje mogu dati mada u manjem procentu, lažno pozitivne rezultate zbog prisustva bakterijskih ili gljvičnih komponenata. Sintetski peptidi imaju najmanju mogućnost razvoja lažno pozitivnih rezultata, imaju povećanu osetljivost i raniju mogućnost detekcije serokonverzije. Poseban problem lažne pozitivnosti predstavlja dijagnostika ove infekcije kod novorodjenčadi HIV-om inficiranih majki, kod kojih se majčina antitela održavaju i do 18 meseci. Ovaj problem se rešava PCR testom za detekciju provirusne DNK, a potom i virusne RNK.
Drugi problem sa testovima za skriniranje je pojava lažno negativnih rezultata. Uzrok može biti mala količina antigena primenjenog u testu ili neadekvatna sekvenca virusnog genoma upotrebljena za pripremanje testa, period "prozora", nizak titar antitela (kod uznapredovale bolesti) ili nemogućnost detekcije virusnog podtipa (podtip O predstavlja najveći problem). Testovi koji se primenjuju od 1998. imaju oznaku da li detektuju i podtip O. Serološki testovi postaju pozitivni tek 22-27 dana posle akutne infekcije, a u proseku posle 6 nedelja do 6 meseci (15).
Večina problema i lažne pozitivnosti a delimično i lažne negativnosti mogu se rešiti primenom potvrdnih, konfirmativnih testova.
2. Potvrdni test (Western blot): U slučaju pozitivnog imunoenzimskog testa, potrebno je ponoviti isti test ili uraditi imunoenzimski test drugog proizvodjača, a potom iz istog uzorka ili još bolje iz novog uzorka seruma pacijenta uraditi potvrdni, Western blot test (16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23). Čvrsta faza kod bloting testa su nitrocelulozne membrane na koje su preneti pojedinačni, elektroforetski razdvojeni virusni antigeni. Po istom principu kao i ostali imunoenzimski testovi uz pomoć konjugata (antihumanih antitela konjugovanih sa enzimom i supstrata koji je specifičan za taj enzim, pod čijim uticajem menja boju), moguća je vizualizacija pojedinačnih antitela. Očitavanje se vrši golim okom komparacijom sa kontrolama ali je moguće i kompjuterizovano očitavanje. Western blot je prvenstveno kvalitativni test, ali je intenzitet boje na pojedinim trakama proporcionalan koncentraciji antitela, te se može tumačiti i semikvantitativno (-, +-, + i ++). Rezultati Western blota tumače se kao negativni, pozitivni i neodredjeni (indeterminantni). Kriterijumi za izdavanje pozitivnih rezultata su različiti, ali se najčešće primenjuje onaj po kome je pozitivan onaj nalaz koji ima prisutna bar tri antitela: 1. jedno od antitela na gag antigene (p17, p24 ili p55), 2. antitelo za transmembranski glikoprotein omotača (gp41) i 3. jedno od antitela na antigene velikih glikoproteina omotača (gp120 ili gp160) (24). Prisustvo ostalih antitela olakšava tumačenje. Sve ostale kombinacije oznažavaju se kao neodredjene ili indeterminantne i zahtevaju ili praženje na 3-6 mneseci ili primenu PCR testa za detekciju virusne DNK ili RNK.
Western blot test je veoma značajan i za praćenje progresije HIV infekcije. U toku serokonverzije prvo dolazi do razvoja antitela na antigene virusnog omotača i virusnog jezgra (env i gag), a poslednja se stvaraju antitela za virusne enzime (pol). Kod vertikalne transmisije u serumu novorodjenčeta prvo izčezavaju majčina antitela za antigene virusnih enzima, a ukoliko je dete inficirano ova antitela se poslednja sintetišu. Koncentracija antitela za antigene virusnog jezgra (p17, p24 i p55) govori indirektno i o imunološkom statusu (25, 26). Sa napredovanjem HIV infekcije i progresijom imunosupresije postepeno opada koncentracija antitela za antigene virusnog jezgra (prvo za p17 a potom i p24 i p55), da bi kod razvijenog AIDS-a ona bila nedetektibilna. Western blot analiza cerebrospinalne tečnosti uporedo sa analizom seruma može da ukaže na HIV infekciju CNS (27).
3. Testovi aviditeta specifičnih antitela:Relativno jednostavna dijagnostička metoda koja može biti veoma korisna u odredjivanju prognoze HIV infekcije je odredjivanje aviditeta specifičnih antitela na antigene virusnog jezgra (p17 i p24) i na transmembranski glikoprotein (gp41). Prisustvo antitela visokog aviditeta je veoma značajno za kontrolu virusne replikacije. Na devetogodišnjim studijama sprovedenim medju hemofiličarima dokazano je da su asimptomatski HIV inficirani pacijenti vi{e godina imali antitela visokog aviditeta, dok je kod progresora vrlo rano dolazilo do pojave nisko aviditetnih antitela za p17 i p24 (28, 29, 30). Aviditet antitela za gp41 nema prognostički značaj, ali ukazuje na starost infekcije. Pacijenti sa svežom infekcijom ili nedavnom serokonverzijom imaju nisko aviditetna antitela za gp41, dok pacijenti sa starom infekcijom imaju visoko aviditetna antitela za gp41. Održavanje niskoaviditetnih antitela za p17 i p24 u ranoj fazi infekcije ukazuje na lošu prognozu i skori razvoj ARC-a i AIDS-a. Titar i aviditet antitela za antigene virusnog jezgra (p17 i p24) su raniji prognostički markeri od antigena p24 i broja CD4 limfocita (17, 23, 31).
| DIREKTNI TESTOVI |
1. ELISA test za HIV antigen p24 značajno skraćuje period "prozora" i omogućava ranu dijagnozu HIV infekcije. U odnosu na tehnike amplifikacije je nedovoljno osetljiv i detektuje antigen tek u koncentraciji >3pg/ml. Odredivanje HIV antigena trebalo bi uvek uraditi pre i posle disocijacije imunih kompleksa, pošto i sasvim mala količina anti-p24 antitela (u titru 1:125) može da veže znatne količine antigena (500- 1 000pg/ml) i tako prouzrokuje lažno negativan rezultat (31). Disocijacijom imunih kompleksa pre odredjivanja koncentracije p24 antigena, povećava se osetljivost testa 4-5 puta, mada može doći i do delimične razgradnje antigena primenjenom kiselinom, posebno kod dece (32). 90% pacijenata sa visokim titrom anti-p24 i anti-gp41 antitela nema antigen ni u slobodnoj ni u vezanoj formi. HIV antigenemia prethodi pojavi AIDS-a 6-30 meseci (33).
2. Izolacija virusa u kulturi limfomonocita: Izolacija HIV-a iz plazme ili limfomonocita je značajna za postavljanje rane dijagnoze HIV infekcije, posebno kod vertikalne transmisije, ali se može obaviti samo u visokospecijalizovanim laboratorijama. U kulturi stimulisanih limfomonocita (mitogen i interleukin-2) mogu se razlikovati sojevi koji indukuju stvaranje sincicijuma (SI) koji su prognostički lošiji, od onih koji ne indukuju stvaranje sincicijuma (NSI) i koji su prognostički bolji znak. Nedostaci ove dijagnostičke metode su pored posebnih uslova za njeno izvodjenje, dugotrajnost (oko 6 nedelja), nedovoljna osetljivost (negativan rezultat ne isključuje infekciju) i visoka cena.
3. Tehnika amplifikacije dela genetskog materijala dugog 200-300 nukleotida, poznata kao PCR ima izuzetni značaj u dijagnostici HIV infekcije. Ovim dijagnostičkim postupkom moguće je rano postavljanje dijagnoze HIV infekcije, odredjivanje prognoze bolesti, donošenje odluke o započinjanju terapije, praćenje uspešnosti primenjene terapije i odredjivanje osetljivosti virusa na antiretrovirusne lekove (razvoj rezistencije).
Postavljanje rane dijagnoze izvodi se primenom kvalitativnog testa za provirusnu DNK. Detekcija DNK je moguća kod pacijenata sa brojem CD4 limfocita >400, pošto je prag osetljivosti testa najmanje 10 kopija DNK na 150 000 limfomonocita (34, 35).
Odredjivanje infektivnog titra plazme pre uvodjenja PCR tehnike bilo je moguće kvantitativnom kulturom limfomonocita. Povišen titar virusa u plazmi ukazuje na kliničku progresiju, dok njegovo opadanje prati uspešno primenjenu terapiju (36, 37). Medjutim manje od 50% pacijenata sa više od 200 CD4+ limfocita/mikrolitru ima pozitivnu kulturu, a potrebno je da dodje do promene kvantiteta od 25 puta da bi se to odrazilo u kliničkoj slici. Za razliku od ove metode, HIV RNK odredjena molekularnim tehnikama (PCR) pozitivna je praktično kod svih HIV inficiranih pacijenata, nezavisno od kliničkog stadijuma. Ovim testom se najranije postavlja dijagnoza akutne HIV infekcije (38, 39). PCR test za RNK pozitivan je 3-5 dana pre testa za p24 antigen, a jednu do tri nedelje pre seroloških testova za antitela (40, 41).
Koncentracije RNK u akutnoj fazi su veoma visoke, i premašuju vrednosti od 50 000 kopija, pa i nekoliko stotina hiljada ili nekoliko miliona (15). Koncentracija virusne RNK u plazmi podložna je veoma dinamičnim promenama i u značajnoj je korelaciji sa stadijumom bolesti, a brzo opada nakon započinjanja efektivne terapije. Odredjivanje plazma koncentracije RNK je važan prognostički marker progresije bolesti. U fazi akutne serokonverzije kao i kod pacijenata sa razvijenom kliničkom slikom AIDS-a (i manje od 100 CD4 limfocita) koncentracija RNK je izmedju 100 i 10 000 TCID/ml, dok je kod asimptomatskih pacijenata (sa >300 CD4 limfocita) ova koncentracija niska ili nedetektibilna. Titar virusa u plazmi najviši je u aktnoj (primarnoj) infekciji (CDC stadijum I) i kasnoj fazi bolesti (CDC IV), a umeren u CDC stadijumu II i III.
Broj CD4 limfocita prihvaćen je kao najbolji prognostički marker HIV bolesti. Tako je dokazano da je rizik od razvoja bolesti i umiranja u periodu od 24 meseca <5% kod pacijenata sa >500 CD4 limfocita, dok je taj rizik >70% kod pacijenata čiji je broj CD4 limfocita <50 (42, 43).
Visok početni nivo HIV RNK je u korelaciji sa niskim brojem CD4 limfocita i njihovim brzim padom, kao i sa brzom progresijom bolesti. Pacijenti sa >100 000 kopija RNK/ml u toku 6 meseci nakon serokonverzije imaju 10 puta više šanse da u roku od 5 godina razviju AIDS nego oni sa <100 000 kopija/ml (40). Pacijenti koji održavaju koncentraciju <10 000 kopija/ml u ranoj fazi infekcije neće progredirati u AIDS u toku sledećih pet godina.
Nedavno sprovedeno ispitivanje na 181 pacijentu pokazalo je da i samo jedno odredjivanje koncentracije RNK pruža važne prognostičke informacije. Pacijenti sa početnom koncentracijom plazma RNK >10 000 kopija/ml iako im je broj CD4>500, u >70% slučajeva razvili su AIDS i umrli u desetogodišnjem periodu. Nasuprot njima oni čiji je početni nivo plazma RNK bio <10 000 razvili su AIDS i umrli u <30% slučajeva. Trostruko veći početni nivo plazma RNK daje 60% povećan rizik smrtnosti. Ovo ukazuje da je početni plazma RNK nivo značajan prognostički marker za dugotrajni period, dok je broj CD4 limfocita značajan prognostički marker za sadašnju situaciju (napr. oportunističke infekcije). Neki autori (44, 45, 46, 47, 48, 49) kao prognostički sigurniji smatraju nivo RNK u plazmi odredjen dve godine posle serokonverzije, pošto se u tom periodu nakon visokog nivoa u akutnoj infekciji koncentracija virusne RNK ustali na nivou koji ima prognostički značaj. Praćenje koncentracije virusne RNK kod hroničnih asimptomatski HIV inficiranih hemofiličara, sa niskom koncentracijom RNK (<5 000 kopija/ml) i sa CD4 limfocitima >500, pokazalo je da je do povećanja koncentracije RNK u toku 11 godina došlo kod 14% pacijenata, i to kod onih čija je koncentracija bila 2 000-5 000 kopija, a ne niža (17, 21).
Preporučuje se odredivanje koncentracije RNK u plazmi kao početno dva puta, u razmaku od dve nedelje, a potom se prati uporedo sa odredjivanjem broja CD4 limfocita na 3 do 4 meseca. Kada se započne specifična terapija koncentraciju RNK treba kontrolisati posle 3-4 nedelje od početka terapije, ili posle promene terapije.
Većina autora ne primenjuje antiretrovirusnu terapiju kod koncentracija od 5 000-10 000 kopija/ml. Terapija kod pacijenata sa koncentracijom HIV RNK izmedju 10 000-30 000 kopija/ml započinje se u zavisnosti od broja CD4 limfocita i kliničke slike. Kod pacijenata čiji je nivo RNK >30 000-50 000 kopija/ml terapija se započinje bez obzira na broj CD4 limfocita i klinički status. Minimalni odgovor koji ukazuje na povoljan efekat terapije je trostruki pad koncentracije RNA (0.5 log) (50). Idealno je postići nedetektibilan nivo RNK, ali to kod večine pacijenata nije moguće. Povratak koncentracije RNK na preterapijski nivo, potvrdjeno sa bar dva odredjivanja, ukazuje na neuspeh terapije. Porast koncentracije (i to >100-300 puta) zapažen je posle vakcinacije (influenza, tetanus, pneumokok) ili u toku reaktivacije genitalnog herpesa ili tuberkuloze. Kod ovih pacijenata plazma koncentracija RNK se vraća na prevakcinalni nivo u periodu od četiri nedelje.
Efektivna antivirusna terapija dovodi do značajnog pada plazma koncentracije RNK u toku nedelju dana od započinjanja terapije. Ukoliko ne dodje do značajnih promena u tom periodu primenjena terapija nema uspeha. Kod pacijenata kod kojih dodje do pada koncentracije a potom do ponovnog porasta, gubitak antivirusnog efekta terapije vezan je za razvoj rezistentnih sojeva virusa.
U tom slučaju se posle amplifikacije može odrediti osetljivost virusnog soja odnosno dokazati razvoj rezistencije na primenjeni lek i na vreme korigovati terapiju.
| Zaključak |
Testovi za detekciju anti-HIV antitela veoma su efikasni i značajni u smanjenju rizika prenosa HIV infekcije putem krvi i krvnih preradjevina, kao i za postavljanje dijagnoze kod asimptomatskih, HIV-om inficiranih osoba. Usavršavanjem ELISA testova povećana je mogućnost rane detekcije HIV infekcije sa osetljivošću od preko 99% ali je potrebno proširiti detektibilnost testova na što veći broj podtipova. Potvrdnim testovima (Western blot) isključuje se lažna pozitivnost. Testovima za detekciju virusnog genoma (provirusne DNK) ili virusnih antigena (p24) skraćuje se period lažne negativnosti (rana faza serokonverzije) i omogućava rano postavljanje dijagnoze, posebno kod neonatale HIV infekcije.
Testovima za detekciju i kvantifikaciju slobodne virusne RNK omogućeno je odredjivanje aktivnosti HIV infekcije, dijagnoza HIV infekcije CNS-a, prognoza HIV infekcije, donošenje odluke o započinjanju terapije, praćenje uspešnosti primenjene terapije i otkrivanje razvoja rezistencije virusa na primenjenu terapiju.
Kombinacijom indirektnih i direktnih testova za HIV može se rano postaviti dijagnoza ili isključiti infekcija. Saznanje o postojanju HIV infekcije omogućava da se preduzmu mere za sprečavanje daljeg širenja infekcije (putem krvi, seksualnim putem i vertikalna transmisija). Savremeni dijagnostički postupci pružaju mogućnost uspešnije primene i praćenja uspeešnosti antiretrovirusne terapije.
| Literatura |
1. Nuwayhid N.: Laboratory tests for detection of human immunodeficiency virus type 1 infection, Cl Diag Lab Immunology 1995,2:637-645
2. Davey R., Lane H.: Laboratory methods in the diagnosis and prognosic staging of infection with human immunodeficiency virus type 1, Rev Infect Dis 1990, 12:912-929
3. Farzadegan H., Henrard D., Kleeberger C., Schrager L., Kirby A., Saah A. i dr.: Virologic and serologic markers of rapid progression to AIDS after HIV-1 seroconversion, J AIDS and H retrovirol 1996, 13:448-455
4. Weiblen B., Schumacher R., Garrett P., Hoff R.: IgA and IgM human immunodeficiency virus antibodies in weakly reactive or false-negative blood donors, Transfusion 1991, 31:397-400
5. McAlpine L., Gandhi J., Parry J., Mortimer P.: Thirteen current anti-HIV-1/HIV-2 enzyme immunoassays: how accurate are they?, J MedicVirol 1994, 42:115-118
6. Beebe J., Briggs L.: Evaluation of enzyme-linked immunoassay systems for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibody from filter paper disks impregnated with whole blood, J Clinic Microbopl 1990, 28:808-810
7. Evengard B., Ehrnst A., von Sydow M., Pehrson P., Lundberg P., Linder E.: Effect of heat on extracted HIV viral infectivity and antibody activity using filter paper technique of blood sampling, AIDS 1989, 3:591-595
8. Evengard B, von Sydow M., Ehrnst A., Pehrson P., Lundberg P., Linder E.: Filter paper sampling of blood infected with HIV: effect of heat on antibody activity and viral infectivity, BJM 1988, 297:1178
9. Holmstrom P., Syrjanen S., Laine P., Valle S., Suni J.: HIV antibodies in whole saliva detected by ELISA and Western blot assays, J Medic Virol 1990, 30:245-248
10. Cao Y., Hosein B., Borkowsky W., Mirabile M., Baker L., Baldwin D., Poiesz B., Friedman-Kein A.: Antibodies to Human Immunodeficiency Virus type 1 in the urine specimens of HIV-1-seropositive individuals, AIDS Res Hum Retrov 1989, 5:311-319
11. Cao Y., Friedman-Kien A., Chuba J., Mirabile M.: IgG antibodies to HIV-1 seropositive individuals, Lancet 1988, I:831-832
12. Reagan K., Lile C., Book G., Devash Y., Winslow D., Binscik A.: Use of urine for HIV-1 antibody screening, Lancet 1990, 335:421-422
13. Van den Akker R., van den Hoek A., van den Akker W., Kooy H., Vijege E., Roosendaal G., Coutinho R., van Loon A.: Detection of HIV antibodies in saliva as a tool for epidemiological studies, AIDS 1992, 6:953-957
14. Viscidi R., Hill P., Li S., Cerny E., Vlahov D., Farzadegan H.: Diagnosis of HTLV-I and HTLV-II infection by enzyme immunoassay using synthetic peptides, J ADIS 1991, 4:1190-1198
15. Kahn J., Walker B.: Acute Human Immunodeficiency Virus type 1 infection, N Engl J Med 1998, 339:33-39
16. Urassa W., Matunda S., Bredberg-Raden U., Mhalu F., Biberfeld G.: Evaluation of the WHO human immunodeficiency virus (HIV) antibody testing strategy for the diagnosis of HIV infection, Cl Diag Virol 1994, 2:1-6
17. Centers for Diseases Control (CDC): Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infections, MMWR 1989, 38(S7):1-7
18. Doerr H: Viral diseases-Human immunodeficiency virus type 1 and 2 (HIV-1, HIV-2), Laboratory diagnosis, in: Lothar T: Clinical laboratory diagnosis: use and assesment of clinical laboratory results, TH-Books-Verl. Ges., Frankfurt/Main 1998:1240-1244
19. Drabich J., Baker J.: HLA antigen contamination of commercial Western blot strips for detecting human immunodeficiency virus, J Infect Diseas 1989, 159:357-358
20. Sayre K., Dodd R., Tegtmeier G., Layug L., Alexsander S., Busch M.: False-positive human immunodeficiency virus type 1 Western blot tests in noninfected blood donors, Transfusion 1996, 36:45-52
21. Pepin J., Dalby M., Gaye I., Berry N., Whittle H.: Long-terme follow-up of subjects with an indeterminate HIV-2 Western blot, AIDS 1991, 5:1274-1275
22. Neifer S., Molz B.: Retrospective bewertung des Western blot zur erfassung fruher HIV-infectionen, Das Gesundheitswesen 1995, 57:489-493
23. Celum C., Coombs R., Lafferty W., Inui T., Gates C.: Indeterminate human immunodeficiency virus type 1 Western blots: seroconversion risk, specifity of supplemental tests, and an algorithm for evaluation, J Infect Dis 1991, 164:656-664
24. Sayre K., Dodd R., Tegtmeier G., Layug L., Alexsander S., Busch M.: False-positive human immunodeficiency virus type 1 Western blot tests in noninfected blood donors, Transfusion 1996, 36:45-52
25. Lange J., Patil D., Huisman H.: Persistent HIV antigenemia and decline of HIV core antibodies associated with transition to AIDS, Br Med J 1986, 293:1459-1462
26. Moss A.: Laboratory markers as potential surrogates for clinila outcomes in AIDS trials, J AIDS 1990, 3(S2):69-71
27. Žerjav S.: Markeri HIV infekcije centralnog nervnog sistema, Doktorska disertacija, Medicinski fakultet, Univerzitet u beogradu, 1994.
28. Chargelegue D., Stanley C., O,Toole C., Colvin B., Steward M.:The affinity of IgG antibodies to gag p24 and p17 in HIV-1-infected patients correlates with disease progression, Clin Exp Immunol 1995, 99:175-181
29. Chargelegue D., Stanley C., O,Toole C., Colvin B., Steward M.: The absence or loss of antibodies of high affinity to human immunodeficiency virus (HIV) is associated with disease progressio0n in HIV-1 infected patients, J Infect Dis 1995, 172:897-898
30. Thomas H., Wilson S., O,Toole C., Lister C., Saeed A., Watkins R., Morgan-Capner P.: Differential maturation of avidity of IgG antibodies to gp41, p24 and p17 following infection with HIV-1, Clin Exp Immunol 1996, 103:185-191
31. Dennin R., Dalhoff K.: HIV p24 antigen concentration in serum of 11 anti-HIV 1 positive patients before and after immune-complex dissociation: a study of a 5-year period, Cl Diag Virol 1995, 3:131-137
32. Melvin A., Mohan K., Dragavon J.: ICD p24 antigen in HIV-infected children with low HIV-specific antibody, Pediatric AIDS and HIV Infect 1995, 6:356-357
33. Potera M., Vitale F., LaLicata R., Alesi D., Lupo G., Bonura F., Romano N,. DiCuonzo G.: Free and antibody-complexed antigen and antibody profile in apparently healthy individuals and in AIDS patients, J Medic Virol 1990, 30:30-35
34. Saag M., Holodniy M., Kurtzkes D., O,Brien W.i dr: HIV viral load markers in clinical practice, Nature Med 1996, 2:625-629
35. Dieng Sarr A., Hamel D., Thior I., Kokkotou E., Sankale J., Marlink R.: HIV-1 and HIV-2 dual infection: lack of HIV-2 provirus correlates with low CD4+ lympocyte counts, AIDS 1998,12:131-137
36. Vidal C., Garcia F., Romeu J., Ruiz L., Miro J., Cruceta A., Soriano A., Pumarola T., Clotet B., Gatell J.: Lack of evidence of a stable viral load set-point in early stage asymptomatic patients with chronic HIV-1 infection, AIDS 1998, 12:1285-1289
37. Garcia F., Vidal C., Gatell J., Miro J., Soriano A., Pumarola T.: Viral load in asymptomatic patients with CD4+ lymphocyte counts above 500x106/l, AIDS 1997, 11:53-57
38. Falke D.: Erworbenes Immunodefektsyndrom (AIDS), in: Falke D.: Virologie am Krankenbett, Klinik, Diagnostik, Therapie, SpringerBerlin 1998:239-269
39. Sabin C., Devereux H., Phillips A., Janossy G., Loveday C., Lee C.: Immune markers and viral load after HIV-1 seroconversion as predictors of diseases progression in a cohort of haemophilic men, AIDS 1998, 12:1347-1352
40. Mellors J., Rinaldo C., Gupta P., White R., Todd J., Kongsley L.: Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma, Science 1996, 272:1167-1170
41. Paxton H., Pins M., Denton G., McGonigle A., Meisner P., Phair J.: Comparison of CD4 cell count by a simple enzyme-linked immunosorbent assay using the TRAx CD4 test kit and by flow cytometry and hematology, Cl Diag Lab Immunol 1995, 2:104-114
42. Schnittman S., Greenhouse J., Psaallidopoulos M., Baseler M., Salzman N., Fauci A.: Increasing viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppresion and clinical disease, ann Intern Med 1990, 113:438-443
43. Imagawa D., Lee M., Wolinsky S., Sano K., Morales F.: Human immunodeficiency virus type 1 infection in homosexsual men who remain seronegative for prolonged periods, N Engl J Med 1989, 320:1458-1462
44. Hogersvorst E., Jurriaans S., de Wolf F., van Wijk A., Wiersma A., Valk M., Roos M. i dr.: Predictors for non- and slow progression in human immunodeficiency virus (HIV) type 1 infection: low viral RNA copy numbers in serum and maintance of high HIV-1 p-24-specific but not V3-specific antibody levels, JID 1995, 171:811-821
45. Di Stefano M., Fiore J., Chironna M., Romanelli C., La Grasta L., Quarto M., Angarano G., Pastore G.: P24 antigen detection, viral isolation, DNA-PCR and in vitro antibody production for the diagnosis of HIV-1 latent infection in heterosexsual women at high risk for HIV-1 infection, Genitourinary Medicine 1995, 71:123-125
46. Nkenngasong J., Peeters M., Nys P., Piot P., van der Groen G.: Infectious virus titer, replicative and syncytium-inducing capacity of human immunodeficiency virus type 1, J Medic virol 1995, 45:78-81
47. Katzenstein T., Pedersen C., Nielsen C., Lundgren J., Jacobson P., Gerstoft J.: Longitudinal serum HIV RNA quantification: correlation to viral phenotype at seroconversion and clinical outcome, AIDS 1996, 10:167-173
48. Caliendo A.: Methods, interpretation and applications of HIV-1 viral load measurments, Cl Microb Newslett 1997, 19:1-5
49. Escaich S., Ritter J., Rougier P., Lepot D., Lamelin J., Sepetjan M., Trepo C.: Plasma viremia as a marker of viral replication in HIv-infected individuals, AIDS 1991, 5:1189-1194
50. Fahey J., Taylor J., Detels R., Hofmann B., Melmed R., Nishianian P., Giorgi J.: The prognostic value of cellular and serologic markers in infection with human immunodeficiency virus type 1, N Engl J Med 1990, 322:166-172
51. Ho D.: Viral counts count in HIV infection, Science 1996, 272:1124-1125