ACTA FAC. MED. NAISS. 2003; 20 (1): 6 - 10

Stručni rad
 

KARAKTERISTIKE vacA GENOTIPOVA HELICOBACTERA PYLORI I KORELACIJA SA ISHODOM INFEKCIJE
 

Marina Dinić, Marica Otašević, Gordana Tasić, Dobrila Đorđević, Biljana Miljković- Selimović, Ljiljana Otašević
Institut za mikrobiologiju i imunologiju Niš, Oftalmološka klinika Kliničkog centra Niš
 

UVOD

Helicobacter pylori (H. pylori) je Gram negativan bacil, savijen u obliku slova S. Ovaj mikroorganizam kolonizuje sluzokožu želuca izazivajući hronični superficijalni gastritis. H. pylori infekcija je široko rasprostranjena u svetskoj populaciji i prevalenca se kreće od 20-50% u razvijenim do 80% u zemljama u razvoju (1). H. pylori infekcija praćena je humoralnim i ćelijskim imunskim odgovorom. Međutim, organizam domaćina ne uspeva da eliminiše ovaj mikroorganizam. Jednom nastala H. pylori infekcija, ukoliko se ne leči, perzistira decenijama, verovatno i celog života (2). Karakteristično je da kod većine inficiranih ne dolazi do pojave simptoma oboljenja, dok se kod malog broja razvija simptomatski gastritis, peptička ulkusna bolest, karcinom želuca i MALT limfom.
Smatra se da je dužina trajanja infekcije jedan od faktora koji povećava rizik za razvoj težih oboljenja gornjeg gastrointestinalnog trakta (7). Međutim, mnogi autori ukazuju na značaj pojedinih faktora virulencije H.pylori. Dokazano je da se sojevi H.pylori razlikuju po tome da li poseduju ili eksprimuju neke faktore virulencije (3-6). Najznačajnijim faktorima virulencije smatraju se ureaza, adhezini, pokretljivost, heat shock proteini, vakuolizirajući citotoksin, a definisani su geni koji kodiraju njihovu sintezu (7).
H. pylori pokazuje visok nivo genetske varijabilnosti, (7) međutim, razlike u fenotipskim osobinama su male. Najznačajnije razlike u fenotipskim osobinama između H. pylori sojeva odnose se na produkciju vakuolizirajućeg citotoksina A (vacA) i citotoksin udruženog proteina A (cagA). Citotoksin udruženi protein A je snažan imunogeni protein, molekulske težine 120kD. Sintezu ovog proteina kodira cagA gen koji se nalazi u cag ostrvu patogenosti (cag patogenicity island) (7). To je segment od 40kb u kome se, pored cagA gena, nalazi još nekoliko gena koji kodiraju sintezu proteina značajnih za virulenciju H. pylori. Smatra se da je najznačajnija uloga ovih proteina u stimulaciji produkcije proinflamatornih citokina (6).
Zapaženo je da sojevi H. pylori koji poseduju cagA gen i cagA protein produkuju i vakuolizirajući citotoksin A (vacA). Međutim, istraživanje Rudi i sar. (2) pokazalo je da prisustvo cagA gena nije striktno povezano sa citotoksičnom aktivnošću.
VacA je egzotoksin molekulske težine 90kD. Citotoksičnu aktivnost H. pylori prvi su opisali Leunk i sar. (8), pokazujući da supernatant kulture 50% ispitivanih sojeva dovodi do vakuolizacije eukariotskih ćelija. Istraživanja mnogih autora pokazala su da vacA toksin produkuje 45 - 60% sojeva H. pylori (3). Ovaj toksin u uslovima in vitro dovodi do vakuolizacije HeLa i gastričnih epitelnih ćelija. Smatra se da su oštećenja koja nastaju delovanjem vacA toksina blisko povezana sa patogenezom peptičke ulkusne bolesti i karcinoma želuca (4).
Sintezu vacA toksina kodira vacA gen i mada je prisustvo ovog gena povezano sa prisustvom cagA gena, oni se na hromozomu nalaze udaljeni jedan od drugog oko 300kb (5). Rhadnis i sar. (9) utvrdili su da vacA gen čini 3888 nukleotida koji kodiraju sintezu 1296 amino kiselina. Analiza nukleotidnih sekvenci vacA gena pokazala je da ovaj gen kodira protoksin molekulske težine 139kD koji ima tri regiona i to:
- Vodeća sekvenca od 33 amino kiselina
- region aktivnog citotoksina od 90kD
- C-terminalni region od 48kD koji se odvaja (10).
Ispitivanja vacA gena različitih sojeva H.pylori pokazala su da pojedini regioni ovog gena mogu biti raznoliki (3). Klasifikacija mozaične strukture vacA gena mogla bi biti značajna za procenu rizika za razvoj težih oboljenja kod H.pylori inficiranih osoba, kao i za sagledavanje distribucije različitih sojeva u svetskoj populaciji.
Na 5' kraju vacA gena nalazi se signalna sekvenca od 50 parova baza ili region označen sa "s". Sojevi H. pylori mogu posedovati jedan od dva tipa signalne sekvence: s1 i s2 (3). Tip s1 deli se na podtipove s1a, s1b i s1c. Podtip s1c nađen je samo kod osoba poreklom iz Azije, što ukazuje na razlike u geografskoj distribuciji sojeva (11).
U središnjem delu vacA gena nalazi se region od 700 parova baza koji se takođe može razlikovati kod različitih sojeva H. pylori. Ovaj region je označen sa "m". Sojevi H. pylori mogu posedovati jedan od dva tipa srednjeg regiona: m1 i m2 (3).
Mozaičnom kombinacijom tipova i podtipova signalne sekvence i srednjeg regiona vacA gena određeni su sledeći genotipovi: s1a/m1, s1b/m1, s1a/m2, s1b/m2 i s2/m2. Atheron i sar. (3) su ispitivali ove genotipove H. pylori kod sojeva izolovanih iz sluzokože želuca inficiranih osoba u SAD. Ovi autori su zapazili razlike u nivou produkcije citotoksina, intenzitetu inflamacije i stepenu oštećenja gastričnog epitela koje su povezane sa razlikama u genotipu.
Citotoksična aktivnost je ispitivana merenjem citotoksina prisutnog u supernatantu bujonske kulture ispitivanih genotipova H.pylori. Sojevi H.pylori genotipa s1/m1 pokazuju visok nivo citotoksične aktivnosti, pri čemu je citotoksična aktivnost sojeva s1a/m1 bila viša od sojeva s1b/m1. Sojevi genotipa s1/m2 pokazuju niži nivo citotoksične aktivnosti od sojeva genotipa s1/m1. Pri tom nije utvrđena razlika povezana sa podtipovima signalne sekvence, odnosno između s1a/m2 i s1b/m2. Utvrđeno je da sojevi genotipa s2/m2 produkuju vrlo malo ili uopšte ne produkuju citotoksin (3).
Intenzitet inflamacije kod H. pylori infekcije određivan je na osnovu gustine infiltracije neutrofilima i limfocitima nađene u bioptatu sluzokože želuca. Kod infekcija izazvanih sojevima s1a genotipa, intenzitet inflamacije je bio viši u odnosu na one koje su izazvane sojevima s1b i s2 genotipa. Nije zapažena povezanost intenziteta inflamacije sa tipovima srednjeg regiona (m tipovi) vacA gena (3).
Ispitivanje oštećenja epitela obuhvatalo je utvrđivanje povezanosti različitih genotipova sa degeneracijom epitela, razgradnjom mukusa i stvaranjem mikroskopskih erozija. Razlike u stepenu oštećenja gastričnog epitela bile su povezane sa razlikama vacA gena u oblasti srednjeg regiona, dok razlike u oblasti signalne sekvence nisu bile od značajnog uticaja. Sojevi koji su posedovali m1 tip vacA gena uzrokovali su veća oštećenja gastričnog epitela od sojeva m2 tipa (3) .
Korelaciju vacA genotipova H. pylori sa patohistološkim nalazom bioptata sluzokože želuca kod inficiranih osoba u Nemačkoj ispitivali su Han i sar. (12). Ovi autori sagledavali su povezanost vacA genotipova sa stepenom infiltracije mononuklearnim ćelijama, neutrofilima i gustinom prisutnih bakterijskih ćelija. Kod trećine ispitivanih sojeva ovi autori dokazuju prisustvo srednjeg regiona koji ne pripada ni m1 ni m2 tipu. Oni pretpostavljaju da se možda radi o novom m3 tipu srednjeg regiona vacA gena. U poređenju sa m1 tipom zapaženo je da je m3 tip povezan sa većom gustinom bakterijskih ćelija u antrumu. Analizom tipova signalne sekvence autori dolaze do zaključka da postoji značajna korelacija vacA s1 genotipa sa gustinom bakterijskih ćelija i intenzitetom gastrične inflamacije.
Rezultati istraživanja Nogwira i sar. (13) takođe ukazuju na značajnu korelaciju genotipova H.pylori sa patohistološkim nalazom na sluzokoži želuca kod osoba sa ovom infekcijom. Ovim istraživanjem bili su obuhvaćeni stanovnici Portugalije i Kolumbije. Infekcija sojevima H. pylori koji su vacA s1 i vacA m1 genotipa značajno je bila povezana sa većom gustinom bakterijskih ćelija, intenzivnijom infiltracijom limfocitima i neutrofilima, atrofijom i stepenom oštećenja epitela u odnosu na ostale genotipove.
Mnoga istraživanja (3,6) pokazala su da vacA genotipovi predstavljaju marker virulencije sojeva H. pylori izolovanih kod inficiranih osoba iz SAD i Evrope. Određeni s i m tipovi vacA gena razlikuju se u produkciji citotoksina in vitro, a in vivo u stepenu oštećenja gastričnog epitela, pa se smatra da su određeni genotipovi povezani sa pojavom peptičke ulkusne bolesti (6).
Rudi i sar. (2) su izvršili analizu vacA genotipova H. pylori sojeva izolovanih kod pacijenata sa peptičkom ulkusnom bolešću, hroničnim gastritisom i karcinomom želuca. Ispitivani sojevi H. pylori su u velikom procentu (83.1%) bili vacA s1 genotipa, dok je samo 15.4% bilo vacA s2 tipa. Smatra se da je mali procenat vacA s2 genotipova dobijen zato što su istraživanjem obuhvaćeni pacijenti sa simptomima oboljenja gastrointestinalnog trakta. Pri tom, su sojevi vacA s2 genotipa izolovani samo kod pacijenata sa gastritisom, dok su sojevi vacA s1 genotipa izolovani kod pacijenata sa peptičkom ulkusnom bolešću. Autori stoga zaključuju da bi dokazivanje prisustva ovih sojeva moglo biti od značaja za procenu ishoda H. pylori infekcije.
Analizom tipova srednjeg regiona vacA gena Rudi i sar. (2) ne nalaze značajnu razliku u distribuciji vacA s1m1 i vacA s1m2 genotipova kod osoba sa peptičkom ulkusnom bolešću i onih sa gastritisom. Ovakav nalaz ukazuje da tipovi srednjeg regiona vacA gena nisu povezani sa peptičkom ulkusnom bolešću i da nemaju značaja za predviđanje kliničkog ishoda H. pylori infekcije.
Ovim istraživanjem je ispitivana i citotoksična aktivnost izolovanih sojeva. Poznato je da za razliku od sojeva vacA s1, vacA s2 sojevi produkuju manje količine citotoksina (3). Rudi i sar. (2) imunoblot metodom dokazuju vacA toksin kod 87.2% sojeva vacA s1, a samo kod 30% sojeva vacA s2 genotipa. Citotoksičnu aktivnost na HeLa ćelijama ispoljili su samo sojevi vacA s1 tipa, odnosno samo je jedan soj vacA s2 genotipa izazvao slabu vakuolizaciju. Razlike na nivou srednjeg regiona vacA gena nisu bile povezane sa citotoksičnom aktivnošću.
Razlika između s1 i s2 tipa signalne sekvence vacA gena ogleda se u malom segmentu od 27 parova baza (2). Pretpostavlja se da kod sojeva vacA s2 genotipa izostaje efektivna sekrecija citotoksina kroz citoplazmatsku membranu bakterije. Nasuprot tome, može se pretpostaviti da su razlike u reziduama lokalizovanim na N-terminalnom kraju vacA proteina odgovorne za razlike u funkciji samog proteina i da te razlike na proteinu nastaju zbog različitog mesta odvajanja signalne sekvence u vacA genu kod tipa s1 u odnosu na tip s2.
Polazeći od rezultata istraživanja funkcionalnog efekta mozaične strukture vacA gena H. pylori mnogi istraživači širom sveta pokušali su da definišu povezanost ovih genotipova sa teškim oboljenjima gornjeg gastrointestinalnog trakta. Međutim, dobijeni rezultati se teško mogu interpretirati zbog zapažanja da se podaci dobijeni u različitim delovima sveta, kod različitih etničkih grupa, ne podudaraju.
DeGusimao i sar. (4) prikazali su distribuciju vacA genotipova H. pylori kod inficirane dece Brazila. Ispitivanjem su bili obuhvaćeni pacijenti sa peptičkom ulkusnom bolešću i bez nalaza ulkusa. Dokazana je značajna povezanost vacA s1 genotipa sa peptičkom ulkusnom bolešću, što upućuje na zaključak da viši nivo toksičnosti s1 sojeva, a stoga i veća virulencija u odnosu na s2, doprinosi stvaranju ulkusa. Sojevi vacA s2 dokazani su samo kod dece bez ulkusa.
Sagledavanjem tipova srednjeg regiona, zapažena je značajna povezanost m1 tipova sa peptičkom ulkusnom bolešću, što je u saglasnosti sa nalazom Atheron i sar. (3) koji pokazuje da kod infekcije m1 genotipovima dolazi do oštećenja gastričnog epitela.
Visoka prevalenca vacA s1b podtipova dobijena u ovom istraživanju u suprotnosti je sa prevalencom opisanom u drugim zemljama gde se češće sreću podtipovi s1a i s1c. Međutim, sojevi s1b podtipa se takođe često dokazuju kod stanovnika zemalja sličnih socioekonomskih odnosa i kulture kao što su Portugalija i [panija (4).
DeGusimao i sar. (4) na osnovu rezultata dobijenih ovim istraživanjem zaključuju da određivanje vacA genotipova može biti od značaja za procenu rizika za razvoj teških oboljenja gastrointestinalnog trakta kod dece sa H. pylori infekcijom i da se u skadu sa tim mogu odrediti prioriteti u terapiji ili prevenciji H. pylori infekcije.
Povezanost vacA s1 genotipa sa peptičkom ulkusnom bolešću i karcinomom želuca dokazali su i drugi autori (14-17). Rudi i sar. (15) smatraju da kod osoba inficiranih sojevima vac A s1 genotipa koje nemaju ulkusnu bolest postoji veći rizik da će se ovo oboljenje razviti tokom vremena. Pored toga vanDoorn i sar. (14) zapažaju da je eradikacija H. pylori efikasnija kod infekcije sojevima vacA s1 genotipa što je u saglasnosti sa podacima iz literature koji ukazuju na to da je eradikacija uspešnija kod pacijenata sa ulkusom u odnosu na one koji imaju samo funkcionalnu dispepsiju. Niži nivo rezistencije virulentnih sojeva H. pylori opisana je i u uslovima in vitro (18).
Međutim, u literaturi su opisani i podaci koji ne podržavaju značaj vacA genotipova za razvoj i procenu rizika za nastanak peptičke ulkusne bolesti. Sadakine i sar. (19) kod većine ispitanika dokazuju prisustvo vacA s1 genotipova H. pylori nezavisno od kliničkog nalaza. Zeng i sar. (20) ne nalaze značajnu povezanost vacA genotipova sa peptičkom ulkusnom bolešću. Rezultati Gonzalesa i sar. (21) pokazali su da se procenat nalaza sojeva H. pylori vacA s1 genotipa ne razlikuje značajno kod odraslih osoba sa i bez ulkusa. Pored toga, ovi autori dokazivanjem vacA genotipova dolaze do saznanja da je kod ispitanika često bila prisutna infekcija izazvana multiplim H. pylori sojevima što bi moglo biti razlog visokog stepena genetske varijabilnosti ovog mikroorganizma. Nepodudarnost nalaza virulentnih sojeva H. pylori i peptičke ulkusne bolesti dokazali su i drugi autori (22-24).
Značaj pojedinih faktora virulencije H. pylori za klinički ishod infekcije opisan je u brojnim publikacijama. Mada podaci dobijeni eksperimentom kao i kliničkim istraživanjima, ukazuju na uticaj pojedinih genotipova vacA gena na ishod infekcije, kontradiktorni rezultati umanjuju mogućnost peciznog definisanja uloge ovog faktora virulencije u razvoju teških oboljenja gastrointestinalnog trakta kod osoba sa H. pylori infekcijom. Smatra se da bi trebalo sagledati i druge faktore virulencije H. pylori i da je za razumevanje ove infekcije neophodno uzeti u obzir imunski odgovor domaćina, odnosno interakciju mikroorganizam-domaćin.

LITERATURA

1. Telford JL, Ghiara P, Dell´ Orco M, Comanducci M, Burroni D, Bugnoli M, Tecce MF, Censini S, Covacci A, Xiang Z, Papini E, Montecucco C, Parente L, Rappuoli R. Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric disease. J Exp Med 1994; 179: 1653-1657.
2. Rudi J, Kolb C, Maiwald M, Kuck D, Sieg A, Galle P, Stremmel W. Diversity of Helicobacter pylori vacA and cagA genes and relationship to VacA and CagA protein expression, cytotoxin production and associated diseases. J Clin Microbiol 1998,36: 944-948.
3. Atherton JC, Peek RM, Tham KT, Cover TL, Blaser MJ. Clinical and pathological importance of heterogeneity in vacA, the vacuolating cutotoxin gene of Helicobacter pylori. Gastroenterology 1997; 112: 92-99.
4. De-Gusmao VR, Nogueira-Mendes E, De-Magalhaes-Queiroz-DM, Aguiar-Rocha-G, Camargos-Rocha AM, Ramadan-Ashour AA, Teles-Carvalho AS. VacA genotypes in Helicobacter pylori strains isolated from children with and without duodenal ulcer in Brazil. J Clin Microbiol 2000; 38: 2853-2857.
5. Tummuru MKR, Cover TL, Blaser M.J. Mutation of the cytotoxin - associated cagA gene does not affect the vacuolating cytotoxin activity of Helicobacter pylori. Infect Immun 1994; 62: 2609-2613.
6. vanDoorn LJ, Henskens Y, Nouhan N, Verschuuren A, Vreede R, Herbink P, Ponjee G, vanKrimpen K, Blankenburg R, Scherpenisse J, Quint W. The efficacy of laboratory diagnosis of Helicobacter pylori infections in gastric specimens is related to bacterial density and vacA, caga and iceA genopypes. J Clin Microbiol 2000; 38: 13-17.
7. Dinić M. Određivanje Helicobacter pylori statusa u dečijoj populaciji primenom seroloških metoda. Doktorska disertacija, Medicinski fakultet Niš 1999.
8. Leunk RD, Johnson PT, David BC, Kraft WG, Morgan DR. Citotoxic activity in broth-culture filtrates of Campylobacter pylori. J Med Microbiol 1988; 26: 93-99.
9. Phadnis SH, Ilver D, Janzon L, Normark S, Westblom TU. Pathological significance and molecular characterization of the vacuolating toxin gene of Helicobacter pylori. Infect Immun 1994; 62: 1557-1565.
10. Cover TL, Tummuru MKR, Cao P, Thompson SA, Blaser MJ. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J Biol Chem 1994; 269: 10566-10573.
11. Gold BD, van Doorn L, Guarner J, Owens M, Pierce-Smith D, Song Q, Hutwagner L, Sherman P, deMola LO, Czinn S. Genotypic, clinical and demographic characteristics of children infected with Helicobacter pylori. J Clin Microbiol 2001; 39: 1348-1352.
12. Han SR, Schneider T, Loos M, Bhakdi S, Maeurer MJ. One-step polymerase chain reaction-based typing of Helicobacter pylori vacA gene: association with gastric histopathology. Med Microbiol Immunol Berl 1999; 188: 131-138.
13. Nogueira C, Figueiredo C, Carneiro F, Gomes AT, Barreira R, Figueira P, Salgado C, Belo L, Peixoto A, Bravo JC, Bravo LE, Realpe JL, Plaisier AP, Quint WG, Ruiz B, Correa P, van-Doorn LJ. Helicobacter pylori genotypes may determine gastric histopathology. Am J Pathol 2001; 158: 647-654.
14. van-Doorn LJ, Schneeberger PM, Nouhan N, Plaisier AP, Quint WG, de-Boer WA. Importance of Helicobacter pylori cagA and vacA status for the efficacy of antibiotic treatment. Gut 2000; 46: 321-326.
15. Rudi J, Kuck D, Rudy A, Sieg A, Maiwald M, Stremmel W. Helicobacter pylori vacA genotypes and cagA gene in a series of 383 H. pylori-positive patients. Z Gastroenterol 2000; 38: 559-564.
16. Miehlke S, Kirsch C, Agha-Amiri K, Gunther T, Lehn N, Malfertheiner P, Stolte M, Ehninger G, Bayerdorffer E. The Helicobacter pylori vacA s1, m1 genotype and cagA is associated with gastric carcinoma in Germany. Int J Cancer 2000; 87: 322-327.
17. Tham KT, Peek RM Jr, Atherton JC, Cover TL, Perez-Perez GI, Shyr Y, Blaser MJ. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol 2001; 32: 264-273.
18. Damaso D, Alarcon T, Prieto N, Lopez-Brea M. Relationship between antimicrobial susceptibility and virulence factors in Helicobacter pylori clinical isolates. Rev Esp Quimioter 1999; 12; 340-345.
19. Sadakane Y, Kusaba K, Nagasawa Z, Tanabe I, Kuroki S, Tadano J. Prevalence and genetic diversity of cagD, cagE, and vacA in Helicobacter pylori strains isolated from Japanese patients. Scand J Gastroenterol 1999; 34: 981-986.
20. Zheng PY, Hua J, Yeoh KG, Ho B. Association of peptic ulcer with increased expression of Lewis antigens but not cagA, iceA, and vacA in Helicobacter pylori isolates in an Asian population (see comments) Gut 2000; 47: 18-22.
21. Gonzalez-Valencia G, Atherton JC, Munoz O, Dehesa M, la-Garza AM, Torres J. Helicobacter pylori vacA and cagA genotypes in Mexican adults and children. J Infect Dis 2000; 182: 1450-1454.
22. Ryan KA, Moran AP, Hynes SO, Smith T, Hyde D, O'Morain CA, Maher M. Genotyping of cagA and vacA, Lewis antigen status, and analysis of the poly-(C) tract in the alpha(1,3)-fucosyltransferase gene of Irish Helicobacter pylori isolates. FEMS Immunol Med Microbiol 2000; 28: 113-120.
23. Mukhopadhyay AK, Kersulyte D, Jeong JY, Datta-S, Ito Y, Chowdhury A, Chowdhury S, Santra A, Bhattacharya SK, Azuma T, Nair GB, Berg DE.
Distinctiveness of genotypes of Helicobacter pylori in Calcutta, India. J Bacteriol 2000; 182: 3219-3227.
24. Audibert C, Janvier B, Grignon B, Salaun L, Burucoa C, Lecron JC, Fauchere JL. Correlation between IL-8 induction, cagA status and vacA genotypes in 153 French Helicobacter pylori isolates. Res Microbiol 2000; 151: 191-200.