ACTA FAC. MED. NAISS. 2003; 20 (1): 22 - 28

Pregledni rad

MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOZA HELICOBACTER PYLORI INFEKCIJE

Marica Otašević, Marina Dinić, Biljana Miljković-Selimović, Ljiljana Otašević, Predrag Stojanović Medicinski fakultet, Niš




UVOD

I pored činjenice da su spiralni gastrični mikroorganizmi u nekoliko navrata uočavani od strane histopatologa, njihovo definitivno identifikovanje bilo je moguće tek njihovim uspešnim kultivisanjem (1), jer se, praktično, mikroorganizmi jedino mogu identifikovati mikrobiološkim metodama. Kultivisanje je omogućilo sprovođenje daljih sveobuhvatnih analiza, koje su podrazumevale proučavanje morfologije, gradje, veličine, biohemijske aktivnosti i antigene građe novootkrivenog mikroorganizma.
Za uspešno postavljanje mikrobiološke dijagnoze infekcije izazvane Helicobacterom pylori (H. pylori), moraju biti ispoštovani mnogi uslovi, počev od uzorkovanja, kvaliteta transportnog medijuma, brzine transporta uzorkovanog materijala do laboratorije, pravilne i urgentne obrade materijala, izbora hranljivih podloga i na kraju obezbeđenja mikroaerofilnih uslova i optimalne temperature za rast i razmnožavanje H. pylori. U mikrobiološkoj laboratoriji dijagnoza se postavlja: direktnom mikroskopijom, kultivisanjem i serološkim metodama.
Uzorci uzeti za kultivisanje H. pylori treba da budu zasejani što je moguće pre. Uzorak biopsije treba da bude transportovan u bujonu ili fiziološkom rastvoru, radi zaštite mikroorganizma od isušenja i delovanja atmosferskog kiseonika. Kao transportni medijum mogu se koristiti puferisani i normalni fiziološki rastvor, bujon i tioglikolat bujon. Treba koristiti malu količinu transportnog medijuma, da bi se bioptat homogenizovao pre inokulacije na čvrstu podlogu i svaka bakterija koja bi se eventualno odvojila iz bioptata tokom transporta, mogla ponovo kultivisati. Korišćenjem malih količina hipertoničnih rastvora (20% glukoza) kao transportnog medijuma, održava se struktura uzorka biopsije tako da se bakterije ne odvajaju od mukusnog pokrivača. Optimalno vreme za zasejavanje bolesničkog materijala od momenta uzorkovanja je 2 sata. Uzorci biopsije se mogu čuvati do 5h na 4 °C bez negativnih efekata na kultivisanje mikroorganizma. H. pylori lakše preživljava na temperaturi 4 - 7 °C nego na sobnoj temperaturi. Ako uzorak ne može bili zasejan u toku nekoliko časova, može da se zamrzne na -70 °C u 1 % peptonskoj vodi sa 20% glicerola ili u brucela bujonu sa 20% glicerola.
Za mikrobiološku analizu bolesnički materijal treba obraditi - homogenizovati (poznatom laboratorijskom tehnikom). Homogenat se zatim koristi za pravljenje direktnih mikroskopskih preparata, a potom zasejava na pripremljene hranljive podloge, koje ne treba prethodno sušiti zbog boljeg rasta H. pylori u vlažnoj sredini.

DIREKTNA MIKROSKOPIJA
H. pylori je tanak, savijen u obliku slova S, ponekad i spiralan Gram-negativan bacil. Njegova dužina iznosi 2.5 do 5 µm, a širina 0.5 do 1 µm. Poseduje 4 - 6 monopolarnih flagela. Pravljenje direktnih razmaza uzoraka biopsija i bojenje preparata po Gramu sprovodi se odmah po dostavljanju bolesničkog materijala u laboratoriju. Mikroskopski pregled preparata bojenih po Gramu baziran je na prepoznavanju tipičnih S-oblika Gram-negativnih bacila, raspoređenih pojedinačno ili u grupama.
Marshall (1) je u svom početnom istraživanju primenio tehniku bojenja razmaza želudačnog tkiva i uočio prisustvo savijenih bacila koji podsećaju na Campylobacter. Svi njegovi kultivisani sojevi bili su viđeni i mikroskopiranjem direktnih preparata bojenih po Gramu. Direktna mikroskopija preparata obojenih po Gramu postala je rutinska metoda zajedno sa kultivisanjem mikroorganizma. Mnogi istraživači su sproveli komparativne analize rezultata dobijenih različitim metodama u koje je obavezno uključena i direktna mikroskopija preparata obojenih po Gramu. McMullen (2) je analizirao podudarnost između direktne mikroskopije, kultivisanja i patohistološke metode bojenja po Gimenezu, i ustanovio sledeće: podudarnost između metode po Gramu, kultivisanja i Gimenez metode iznosila je 72%, a podudarnost samo između Gram-metode i Gimenez - histološke metode u 76% slučajeva. Otašević (3) u svom početnom istraživanju takođe primenjuje bojenje po Gramu pored kultivisanja i Warlhin-Starry metode i dobija veći procenat pozitivnih nalaza Gram-metodom u odnosu na kultivisanje, ali znatno niži procenat u odnosu na patohistološku Warthin-Starry metodu. Bojenje razmaza po Gramu predstavlja uspešnu metodu za otkrivanje H. pylori u tkivu želuca, ali se ova metoda nikada ne preporučuje kao jedina. Dobijanje lažno negativnih rezultata je moguće, pogotovu ako je u pregledanom uzorku tkiva prisutan mali broj mikroorganizama. Sledeći nedostatak ove metode je nepostojanost preparata, koji pri uskladištenju brzo blede. Rezultati se izdaju kao pozitivni ili negativni (4).

KULTIVISANJE
Prirodna sredina ove bakterije je sluzokoža želuca. In vitro H. pylori najbolje raste u mikroaerofilnoj atmosferi sa redukovanim kiseonikom 5% i povišenom koncentracijom 5 - 10% CO2. Odgovarajuća atmosfera može se postići na više načina, koji su danas primenljivi i u manjim laboratorijama. Najčešće se upotrebljava “anaerobni” lonac uz korišćenje komercijalnih gasprodukujućih vrećica koje se aktiviraju dodatkom vode, čime se postiže vlažna atmosfera.
Za uspešno kultivisanje H. pylori koriste se različite osnovne podloge sa agarom i dodatkom 5 - 10% ovčje ili konjske krvi. Osnovne upotrebljavane podloge sadrže: krvni agar bazu br. 2 (OXOID), Columbia agar bazu (5), brucela agar, moždano-srčani infuzioni agar (6), triptikaza soja agar, Mueller-Hinton agar, Wilkins-Chalgren agar i GC agar. Većina autora je za kultivisanje H. pylori koristila i čokoladni agar. Literaturni podaci ukazuju na slabi rast H. pylori na podlogama sa: krvnom agar bazom br. 2 (OXOID), GC agar bazom i Mueller-Hinton agaru.
Podloge za primarno izolovanje napravljene su tako da sadrže aktivni drveni ugalj (2 gr/1), ekstrakt kvasca (10 gr/1) i 10% konjskog seruma u moždano-srčanom infuzionom agaru sa trifeniltetrazolijum hloridom (40 mg/1), koji je dodat radi vizuelizacije kolonija, kao i antibakterijske agense koji suprimiraju rast kontaminanata (7). Ova podloga je superiona nad drugim selektivnim i neselektivnim podlogama.
Za primarno izolovanje H. pylori savetuje se selektivna upotreba antibiotskih i antifungalnih agenasa, da bi se inhibirao rast kontaminanata. Kombinaciju antibiotika koju je predložio Skirrow u medijumu sa liziranom krvlju upotrebljavaju mnogi istraživači pri kultivisanju H. pylori.
Marshall (1) preporučuje srčano-moždani infuzioni agar sa dodatkom 7% sveže konjske krvi i sledeću kombinaciju antibiotika: 3 mg/1 vankomicina, 5 mg/l nalidiksinske kiseline, 5 mg/1 trimetoprima i 2 mg/1 amfotericina B.
Povremene gljivične kontaminacije, koje mogu da stvore probleme u loncima sa gasom i vlažnim inkubatorima, mogu biti suprimirane ako se podlogama inkorporira 50 mg/1 cikloheksimida. U nedostatku osnovnih podloga Otašević (3) priprema podlogu sledećeg sastava: filtrat mozga 100 ml, pepton 3 (Torlak) 1.5 gr/100 ml, agar 1.5 gr/100 ml i NaCl 0.5 gr/100 ml. Ovako pripremljena podloga pokazala se veoma efikasnom pri kultivisanju H. pylori.
Uspeh kultivisanja H. pylori zavisi pre svega od stručnosti gastroenterologa (ciljano uzorkovanje tokom gastroskopije), vremena uzorkovanja (u toku prvog meseca bolesti) i brzine transporta bolesničkog materijala do bakteriološke laboratorije. Primećeno je da je selektivna endoskopija koja se obavlja u toku prve ili druge nedelje bolesti, veoma važna za otkrivanje H. pylori kao etiološkog agensa.
U literaturi se navodi širok dijapazon pH vrednosti na kojima raste H. pylori. Vrednosti pH se kreću od 4.5 do 8.0. H. pylori raste posle inkubiranja od 3 do 5 dana na 37°C u vidu konveksnih, glatkih, sjajnih, prozračnih kolonija, ravnih ivica, prečnika 0.5 do 1 mm. Na krvnom agaru daje slabu hemolizu.
Kultivisanje biopsijom uzetog želudačnog tkiva je najpouzdanija metoda pri postavljanju dijagnoze H. pylori infekcije. H. pylori spada u jako zahtevne bakterije i neobezbeđivanje svih potrebnih uslova rezultuje nekultivisanjem mikroorganizma. Marshall je prvi kultivisao spiralni mikroorganizam iz sluzokože želuca korišćenjem “Campylobacter tehnike (1). Za kultivisanje mikroorganizma koristio je neselektivne podloge, krvni i čokoladni agar. Vreme inkubiranja prvog izolovanog soja iznosilo je 6 dana. Kasnije je ustanovljeno da je vremenski period od 3 do 5 dana dovoljan za inkubiranje neselektivnih podloga. Ako se koriste selektivne podloge sa antibioticima, onda je vreme inkubiranja produženo do 7 dana. Bakterijske kulture zamrznute radi konzerviranja, pri supkultivisanju takođe zahtevaju produženo inkubiranje i kolonije postaju vidljive tek posle 6-7 dana inkubiranja.
Na primarnim podlogama H. pylori raste u vidu konveksnih, glatkih, sjajnih, transparentnih kolonija, ravnih ivica prečnika 0.5 - 1 mm (8,3). Na krvnom agaru kolonije stvaraju blagu hemolizu i sivkaste su boje. Ako se podlozi inkorporira trifenil-tetrazolijum hlorid (TTC) u koncentraciji 40 mg/1, kolonije postaju zlatnožuto pigmentisane. Ova osobina je karakteristika H. pylori, jer ni jedna druga bakterija ne daje ovu pigmentaciju. Marshall (1) je u svojoj prvoj studiji kultivisao 96 uzoraka sluzokože želuca i pri tome dobio pozitivne nalaze u 11.45%. Usavršavanjem hranljivih podloga, kultivisanje mikroorganizma je postalo mnogo uspešnije i danas mnoge istraživačke laboratorije uspešno kultivišu H. pylori. Zahvaljujući pre svega kultivisanju mikroorganizma, a i drugim ustanovljenim metodama koje se danas koriste za detekciju H. pylori, rezimirana su sva saznanja o ovom nedavno identifikovanom mikroorganizmu.
U cilju daljeg identifikovanja mikroorganizma sa suspektnih kolonija poraslih na primarnim hranljivim podlogama, prave se mikroskopski preparati, boje po Gramu i mikroskopijom uočavaju savijeni Gram-negativni bacili oblika slova S i U. H. pylori ima osobinu da u starim kulturama ili kulturama koje su izložene atmosferskom kiseoniku, gubi svoju tipičnu spiralnu morfologiju i formira kokoidne forme. U literaturi je opisana mogućnost prelaska H. pylori iz svog normalnog oblika u kokoidni, nakon dužeg boravka mikroorganizma u vodi. Takođe je navedeno da “kokoidne forme mogu biti indukovane subinhibitornim koncentracijama antibiotika in vitro ili in vivo posle neuspešne terapije antibakterijskim lekovima”. Kokoidne forme mogu da se konvertuju u spiralne kultivisanjem, samo posle prolongiranog inkubiranja (9). Mikroskopska verifikacija mikroorganizma upućuje na dalje ispitivanje biohemijskih osobina na osnovu kojih se vrši definitivno identifikovanje spiralnih gastričnih mikroorganizama. Mikroorganizam se identifikuje kao H. pylori ako su testovi ureaze, oksidaze i katalaze pozitivni (6).
I pored svih nabrojanih prednosti, metoda kultivisanja želudačnog tkiva ima svoje nedostatke. Dobijanje lažno negativnih rezultata je moguće kod pacijenata kod kojih je mikroorganizam prisutan u malom broju u želudačnom tkivu, ili kod pacijenata kod kojih je prethodno sproveden antibiotski tretman. Pored toga, nezaobilazni faktori neuspeha kultivisanja su primena neadekvatnih hranljivih podloga kao i neprilagođenost temperature i mikroaerofilije, jer svi oni zajedno predstavljaju osnovni uslov za rast i razmnožavanje H. pylori (4).
 

SEROLOŠKE METODE
Neinvazivnim, serološkim metodama može se postaviti dijagnoza H. pylori infekcije dokazivanjem prisustva anti H. pylori antitela u serumu pacijenata. U toku H. pylori infekcije dolazi do snažnog humoralnog imunskog odgovora koji se karakteriše proliferacijom B limfocita i produkcijom lokalnih i serumskih specifičnih imunoglobulina. Saznanja o antigenoj građi mikroorganizma i specifičnom imunskom odgovoru kod inficiranih osoba, doprinela su razvoju seroloških dijagnostičkih metoda.
Za dokazivanje anti H. pylori antitela mogu se primeniti sledeće serološke metode:
• reakcija vezivanja komplementa
• hemaglutinacija
• bakterijska aglutinacija
• indirektna imunofluorescentna metoda
• ELISA
• imunoblot metoda.
Najveći broj istraživača daje prednost ELISA i imunoblot metodama (11). Utvrđeno je da anti H. pylori antitela pripadaju IgM, IgA i IgG klasama imunoglobulina (12). Mada je prisustvo IgM antitela dokazano u akutnoj eksperimentalnoj i prirodnoj H. pylori infekciji (12), ova antitela nisu specifična i brzo se gube. Prema tome, anti H. pylori IgM antitela nemaju praktičan dijagnostički značaj.
Serološka dijagnoza H. pylori infekcije primenom ELISA metode bazira na dokazivanju specifičnih anti H.pylori IgA i IgG antitela. Opsežno istraživanje Perez-Perez i sar. (13), sprovedeno u cilju određivanja validnosti seroloških metoda u dijagnostici H. pylori infekcije, ukazuje na korelaciju H. pylori kolonizacije i visokog nivoa IgG i IgA antitela, kao i dugotrajno održavanje visokog nivoa anti H. pylori antitela kod inficiranih osoba. Isti autori utvrđuju da prisistvo anti H. pylori antitela nije povezano sa drugim oboljenjima gastrointestinalnog trakta.
Ispitivanja dečije populacije takođe su pokazala značajno viši nivo anti H. pylori IgA i IgG antitela kod pacijenata kod kojih je H. pylori infekcija potvrdjena histološki, kulturelno i ureaza testom, u odnosu na H. pylori negativne pacijente. Međutim, Crabtree i sar. (14) ukazuju na to da je nivo specifičnih antitela kod dece sa H. pylori infekcijom niži nego kod odraslih. Zbog toga su standardni nivoi cut off vrednosti niži u ELISA testovima predviđenim za serološku dijagnozu H. pylori infekcije kod dece.
Brojna istraživanja su pokazala da su kod većine osoba sa H. pylori infekcijom prisutna IgG antitela, a da je mali broj onih kod kojih dolazi do produkcije IgA antitela. Zbog toga se smatra da je ELISA test za dokazivanje anti H. pylori IgG antitela najznačajnija metoda u serološkoj dijagnostici ove infekcije. Međutim, treba pomenuti da dokazivanje IgA antitela ELISA testom povećava preciznost dijagnostičkog postupka, sa aspekta činjenice da se kod nekih osoba javljaju samo anti H. pylori IgA antitela. Na osnovu toga, kompletna serološka dijagnoza H. pylori infekcije obuhvata primenu ELISA testova za dokazivanje obe klase imunoglobulina.
ELISA test je pogodna neinvazivna metoda za praćenje efekta terapije, jer je eradikacija H. pylori praćena postepenim opadanjem nivoa antitela.
Kosunen i sar. (15) su pratili opadanje nivoa anti H.pylori IgG i IgA antitela posle eradikacione terapije. [est nedelja posle terapije došlo je do pada nivoa IgG antitela za 20 - 30%, kod većine bolesnika kod kojih je eradikacija bila uspešna. Po isteku 6 i 12 meseci uočeno je opadanje nivoa antitela za 50% u odnosu na početne vrednosti. Pored toga zapaženo je da nivo IgA antitela opada sporije u odnosu na nivo IgG antitela. Na osnovu rezultata brojnih istraživanja prihvaćen je stav da nakon uspešne eradikacije H. pylori nivo IgA i IgG antitela opada za 40 - 50% u narednih 6 meseci. Ova antitela nestaju iz seruma tek posle 2 godine.
Za serološku dijagnozu H. pylori infekcije može se primeniti i imunoblot, metoda koja je senzitivnija i specifičnija od enzimskog testa. Literaturni podaci ukazuju da su različiti autori koristili imunoblot testove sa različitim antigenima. Pritom je utvrđeno da je imunski odgovor na pojedine bakterijske antigene specifičan za svakog pacijenta, što stvara poteškoće u izboru pogodnih antigena za standardni imunoblot test (11). Prednost ove metode je velika senzitivnost, odnosno mogućnost otkrivanja antitela u akutnoj fazi infekcije koja se enzimskim testom još uvek ne mogu dokazati (12).
Svaka od metoda za dijagnozu H. pylori infekcije ima određene prednosti ali i nedostatke i nijedna ne pokazuje apsolutnu senzitivnost i specifičnost, osim kultivisanja čija specifičnost iznosi 100%. Međutim, neki autori smatraju da nema apsolutno referentne metode. Istraživanje Besta i sar. (16) ukazuje da su serološke metode za dokazivanje anti H. pylori antitela senzitivnije od konvencionalnog “zlatnog standarda” (kultivisanje i histološke metode) zbog toga što je infekcija lokalizovana na ograničenim područjima sluzokože želuca pa su moguće greške pri uzorkovanju sluzokože želuca. Uz navedenu konstataciju treba naglasiti da bi serološke testove trebalo interpretirati uz kompletno kliničko sagledavanje pacijenta.
Mnogi autori preporučuju primenu seroloških metoda pri selekciji bolesnika koji bi bili podvrgnuti endoskopiji. Smatra se da endoskopiji treba podvrgnuti samo one bolesnike kod kojih je serološkom metodom dokazana H. pylori infekcija.
Serološke metode su definisane kao najjednostavnije i najšire primenjivane metode pri epidemiološkom sagledavanju H. pylori infekcije. Primenom ove metode mogu se dobiti potpuniji podaci o prevalenciji H. pylori infekcije, izvoru zaraze i transmisiji. Poseban značaj seroloških metoda i njihova prednost nad ostalim dijagnostičkim metodama, potvrđena je pri ispitivanju H. pylori statusa dečije populacije.
 

PCR METODA
PCR metoda, kojom se dokazuje DNK H. pylori, ima široku primenu u istraživanjima različitih aspekata H. pylori infekcije. U zavisnosti od svrhe istraživanja, za primenu ove metode mogu se koristiti različiti uzorci bolesničkog materijala (sluzokoža želuca, želudačni aspirat, pljuvačka i drugi).
Ova metoda se može primenjivati u cilju postavljanja dijagnoze H. pylori infekcije kada se kao bolesnički materijal koristi uzorak dobijen biopsijom sluzokože želuca i želudačni aspirat. Zbog moguće kontaminacije uzorka i lažno pozitivnog nalaza neophodno je, pored prisustva DNK u uzorku, odrediti i broj bakterija. Dijagnostički značaj ima prisustvo više od 100 mikroorganizama u ispitivanom uzorku.
Želudačni aspirat, koji sadrži dovoljne količine gastričnog mukusa, je pogodniji materijal za primenu PCR metode od bioptata sluzokože želuca zato što mukus sadrži veliki broj ćelija H. pylori i potiče sa celokupne površine sluzokože želuca. Kada se kao materijal koristi želudačni aspirat, poseban dijagnostički značaj ima kvantitativna PCR metoda, jer se može steći uvid u stepen H. pylori infekcije na celokupnoj površini želuca (17).
Primena PCR metode ima značaja i u otkrivanju virulentnih sojeva bakterije. Ovom metodom se može dokazati prisustvo gena cagA, vacA i iceA koji su odgovorni za virulenciju H. pylori. Pored toga, PCR metodom se može izvršiti određivanje vacA genotipova H. pylori, što je od posebnog značaja kada se ima u vidu da su pojedini genotipovi povezani sa ozbiljnim oboljenjima gornjeg gastrointestinalnog trakta (17).
PCR metodom se, takođe, mogu detektovati sojevi H. pylori koji su rezistentni prema klaritromicinu. Dosadašnji podaci iz literature pokazuju da se rezistencija prema klaritromicinu u SAD i u nekim evropskim zemljama javlja u 1% do 9%. Ova rezistencija uslovljena je mutacijom gena za 23S rRNK. Prisustvo ovog gena može se dokazati PCR metodom, kada se kao materijal koristi bioptat sluzokože želuca. Glavni nedostatak ove metode je niska senzitivnost koja je uslovljena mestimičnom lokalizacijom infekcije. Prednost metode je u tome što se za period od nekoliko časova mogu dobiti podaci o rezistenciji na klaritromicin (18).
U kombinaciji sa drugim molekularno-genetskim metodama, PCR se primenjuje i u epidemiološkim istraživanjima H. pylori infekcije. Određivanjem molekularnog otiska DNK H. pylori (fingerprinting) dokazuju se genetski identični izolati. Saznanja dobijena ovim istraživanjima značajna su za praćenje transmisije i otkrivanje izvora zaraze (17).
PCR metoda za dokazivanje DNK H. pylori predstavlja visoko senzitivnu, specifičnu i brzu metodu koja omogućava sagledavanje H. pylori infekcije u različitim kliničkim modalitetima.
 

LITERATURA
 
1. Marshall B. Unidentified curved bacilli on gastric epiyhelium in active chornic gastritis. Lancet 1983; i: 1273-1275.
2. McMullen L, Walker MM, Bain LA, Karim QN, Baron JH. Histological identification of Campylobacter using Gimenez tehnique in gastric antral mucosa. J Clin Pathol 1987; 40: 464-465
3. Otašević M. Izolovanje i identifikovanje kampilobaktera iz kliničkog materijala i materijala sa obdukcije. Doktorska disertacija, Niš, 1989.
4. Otašević M. Helicobacter pylori i oboljenja želuca.Univerzitet u Nišu, 1996.
5. Langenberg W, Rauws EAJ, Widjojokusomo A, Tytgat GNJ, Zanen HC. Indentification of Campylobacter pyloridis isolates by restriction endonuclease DNA anlysis. J Clin Microbiol 1986; 24: 414-17.
6. Queiros DMM, Mendes EN, Rocha GA. Indicator medium for isolation of Campylobacter pylori. J Clin Microbiol 1987; 25: 2378-2379.
7. Glupczynski Y, Labbe M, Thibaumond F. Comparative evaluation of a new selective culture medium for improved isolation of Campylobacter pylori from gastric biopsy sepcimens in Megraud F, Lamouliatte H (eds), Gastroduodenal Pathology and Campylobacter pylori. Elsevier Science Publishers BV 1989; 3-6.
8. Graham DY, Evans DJ, Alpert LC et al. Campylobacter pylori detected non-invasively by the 14C-urea breath test. Lancet 1987; i:1174-1177.
9. Mai U, Geis G, Leying H, Rühl G, Opferkuch W. Dimorphism of Campylobacter pylori. In Megraud F, Lamouliatte H (eds) Gastroduodenal Pathology and Campylobacter pylori. Elsevier Science Publishers BV Amsterdam 1989; 29-33.
10. Goodwin CS, Armstrong JA. Microbiological aspects of Helicobacter pylori (Campylobacter pylori) Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9: 1-13.
11. Newell DG, Stacey AR. The serology of Helicobacter pylori infections. In Rathbone B.J., Heatley, R.V. (eds) Helicobacter pylori and Gastroduodenal Disease. Blackwell Scientific Publikations, Oxford 1992;64-73.
12. Mitchell HM, Hasell SL, Kolesnikow T, Mitchell J, Frommer D. Antigen recognition during progression from acute to chronic infection with a cagA-positive strain of Helicobacter pylori. Infect Immun 1996; 64: 1166-1172.
13. Perez-Perez GI, Dworkin BM, Chods JE, Blaser MJ. Campylobacter pylori antibodies in humans. Ann Int Med 1988; 109:11-17.
14. Crabtree JE, Mahony MJ, Taylor JD, Heatley RV, Littlewood JM, Tompkins DS. Immune responses to Helicobacter pylori in children with recurrent abdominal pain. J Clin Pathol 1991; 44: 768-771
15. Kosunen TU, Seppala K, Sarna S, Sipponen P. Diagnostic value of decreasing IgG, ang IgM antibody titres after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 1992;339:893-95.
16. Best LM, Veldhuyzen van Zanten SJO, Sherman PM, Bezanson GS. Serological detection of Helicobacter pylori antibodies in children and their parents. J Clin Microbiol 1994; 32: 1193-96.
17. Dinić M. Određivanje Helicobacter pylori statusa u dečijoj populaciji primenom seroloških metoda. Doktorska disertacija, Medicinski fakultet Niš 1999.
18. Chisholm S, Owen RJ, Teare L, Saverymuttu S. PCR based diagnosis of Helicobacter pylori infection and real-time determination of claritromycin resistance directly from human gasric biopsy samples. J Clin Microbiol 2001; 39: 1217-20.